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2株B型副鸡禽杆菌的分离鉴定
 

杨国良 ,郑 杰,张 洪,龙进学,张发明,张 坦,孙丰廷,邓秋红,张 红,王文泉*

 

摘要:  2010年3月从北京平谷,2011年12月从北京延庆疑似鸡传染性鼻炎的病鸡体内各分离到1株细菌,根据发病鸡群的临床症状、细菌分离培养、形态观察、过氧化氢酶试验、革兰氏染色结合动物回归试验、免疫攻毒试验和PCR等方法初步鉴定为副鸡禽杆菌(Apg)。同时将分离菌株送匈牙利诗华研发中心进行分型鉴定,确定为B型副鸡禽杆菌,根据分离地点将分离菌株命名为B型副鸡禽杆菌(平谷株和延庆株)。另外通过GenBank与已经发表的Apg基因序列进行同源性比对分析。结果显示,平谷株、延庆株基因序列同源性达到99.6%,而与参考株Modesto的基因核苷酸序列同源性达到98.3%、98.8%。
关键词:副鸡禽杆菌;北京株;分离鉴定;血清型
  鸡传染性鼻炎(Infectious Coryza,IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)引起鸡的一种急性呼吸道疾病,该病可使育成鸡生长发育不良和产蛋鸡产蛋明显下降(可引起产蛋率下降10%~40%)。在我国主要发生在北京、西安等一些北方的养殖场,在南方很少见有报道。其主要特征是发病率高而死亡率低。但饲养环境恶劣、寄生虫、营养不良或伴发其他疾病,如禽痘、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等可使IC传染性鼻炎的病情加重,持续时间会更长,引起死亡率增加。由于康复的带菌鸡是主要的传染源,所以不提倡从不明来源的地方购买种公鸡和开产鸡的习惯做法,除非知道鸡群来源于无IC传染性鼻炎鸡场,否则只应购买1日龄鸡作为后备鸡。预防和控制本病的理想措施是远离老鸡群进行隔离饲养。要从鸡场中彻底消除病原,必须首先清除感染鸡或康复鸡,对禽舍和设备进行清洗和消毒后,在重新饲养清洁鸡之前,禽舍应空闲2~3周。
  按照Page平板凝集试验的分型方法,副鸡禽杆菌可分为A、B和C三个血清型。各型之间不产生交叉保护,一种血清型制备的菌苗免疫鸡只能对同源菌的攻击提供保护。2003年张培君等在辽宁首次分离到了B型副鸡禽杆菌,结合本次北京所分离到的2株B型副鸡禽杆菌,说明我国B型Apg的存在已经不局限于某地的爆发,而是有蔓延的趋势。这就要求现阶段养殖户在免疫时有必要将IC传染性鼻炎疫苗与目标鸡群中存在的血清型相匹配,这样才能达到最理想的免疫效果,防止蔓延。基于此,我们也应该积极研制B型副鸡禽杆菌的单苗或联苗,以打破国内以A型、C型单双价灭活疫苗为主的格局。
1 材料和方法
1.1  材料
1.1.1 标准菌株
  C-Apg-8(Page A 型)由中国兽医药品监察所提供。
1.1.2 鼻炎疫苗  鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗由北京华都诗华生物制品有限公司提供。
1.1.3 培养基  鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂、半合成培养基参照冯文达等的方法制备。
1.1.4 主要试剂及试剂盒  DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs购自TaKaRa公司;其他试剂均为国产分析纯均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.5 病料信息  病鸡来源于北京平谷和延庆某公司鸡场,具有鸡传染性鼻炎的临床症状。主要表现为脸部肿胀,鼻孔有粘性分泌物流出,有时打喷嚏。食欲及饮水减少,体重减轻。精神沉郁,缩头,呆立。6天内蔓延全群,有85%的鸡出现症状。
1.2  方法
1.2.1 菌株分离  将具有典型临床症状的病鸡处死,鸡头表面消毒,无菌切开眶下窦,用接种环蘸取眶下窦内容物,在含有NAD(辅酶Ⅰ、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的鸡血清琼脂平板上划线,同时接种普通肉汤和普通琼脂平板作为对照,然后将平皿倒置于37℃ 5%CO2培养箱内培养16~20h,挑取单个可疑菌落进行纯培养,同时将纯培养产物作为研究对象,进行下一步鉴定。
1.2.2 无菌检验  将北京平谷、延庆所分离的可疑菌落纯培养物接种葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨琼脂(GA)斜面、硫乙醇酸盐(TG)小管各2支,每支0.2mL,其中1支置37℃培养,1支置25℃培养,观察3~5d。
1.2.3 过氧化氢酶试验  挑取典型的菌落进行过氧化氢酶试验,如有气泡即为阳性反应。
1.2.4 种子液活菌计数方法  采用微量点板计数法。选择适宜的四个稀释度,每个稀释度接种2点,接种量为10微升,接种含有NAD的鸡血清琼脂平板使其自然扩散。于CO2培养箱培养18~24h(37℃、5% CO2)。依照GB4789.2-94中的方法开展活菌计数。
1.2.5 PCR鉴定方法  按常规方法处理细菌培养物,将上述培养物取2μL作为模板,进行PCR。PCR程序参照陈小玲等的方法进行:98℃变性2.5分钟。反应过程为94℃ 1分钟,65℃ 1分钟和72℃ 2分钟,循环25次,然后94℃ 1分钟,65℃ 1分钟,72℃ 10分钟循环1次。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析[8]。
1.2.6 引物合成  根据陈小玲等发表文章中已知的引物序列,由Invitrogen北京分公司合成。
上游引物P1:5ˊ- TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT -3ˊ
下游引物P2:5ˊ- CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT -3ˊ
1.2.7 回归试验  取培养至对数生长期的新鲜菌液,经过活菌计数并且将其稀释至规程要求的范围,眶下窦接种70日龄的SPF鸡,其中试验组和对照组分3个隔离器饲养,接种后逐日观察其临床表现。试验情况见表1(略)。
1.2.8 免疫攻毒试验  取60~90日龄SPF鸡28只,其中免疫组、对照组在分别接种A型鼻炎疫苗、PBS 30日后各眶下窦内注射平谷株、延庆株以及A型细菌培养物,分5个隔离器饲养,观察14日,试验情况见表2(略)。
1.2.9 水平传播试验  取60~90日龄SPF鸡40只,其中6只一组(3只作为攻毒组,3只作为PBS对照组),14只一组(3只作为攻毒组,11只作为PBS对照组),分别放入饲养面积相同的1~4号隔离器中饲养。每组鸡按要求各眶下窦内接种平谷株、延庆株细菌培养物,接种后逐日观察其临床表现,试验情况见表3(略)。
1.2.10 分离菌株血清型鉴定  将菌株用20%甘油保存,送匈牙利诗华研发中心代为鉴定。
1.2.11 序列测定与分析  从琼脂糖中回收PCR产物目的片段,用双脱氧法直接对PCR产物进行测序,为了保证序列准确性,同时反向测定序列加以验证。并将所测定的2株B型副鸡禽杆菌基因序列与NCBI基因库中参考株(GenBank登录号:DQ132874.1)相应序列进行比较分析。
2  结果
2.1  细菌分离及初步鉴定 
从平谷、延庆可疑病鸡眶下窦内各分离到1株细菌,此菌在含有NAD的鸡血清琼脂平板上形成边缘整齐,半透明露滴状的小菌落,在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长。挑取可疑菌落进行革兰氏染色,镜下可见两级浓染的革兰氏阴性短杆菌。过氧化氢酶试验结果均为阴性,无菌检验显示葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨琼脂(GA)斜面上均无菌生长,硫乙醇酸盐(TG)小管有轻微细菌生长。
2.2  PCR反应结果  如图1(略)所示,平谷、延庆菌株与标准阳性对照菌株、阴性对照一起,经PCR仪按照设定程序扩增后,经0.8%琼脂糖凝胶电泳25min,结果显示分离菌株与与标准阳性对照菌株均在0.5Kb位置处出现了大小相同的DNA条带,与预期的扩增片段大小一致。
2.3  回归试验  用平谷、延庆分离菌株人工感染SPF鸡24h后均出现食欲减退、眶下窦及脸部严重肿胀、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC临床发病症状。在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡禽杆菌菌落。剖检病变主要为两侧眶下窦内有粘液样物质分泌, 眼结膜充血。接种PBS的对照鸡,至观察结束未出现IC发病症状。
2.4  免疫攻毒试验  副鸡禽杆菌平谷株对照组4/4发病,免疫组1/8保护为不合格;延庆株对照组4/4发病,免疫组0/8保护为不合格(根据中华人民共和国兽药典:对照组4/4发病,免疫组6/8保护为合格。对照组3/4发病,免疫组7/8保护为合格)。而接种A型疫苗+A型菌液的对照组100%保护(4/4)。
2.5  水平传播试验  1、3号隔离器中的攻毒组3/3发病,对照组至观察结束未见IC发病症状。2、4号隔离器中的攻毒组3/3发病,对照组在攻毒后第5天相继出现了食欲减退,脸部肿胀、流鼻涕、打喷嚏等IC发病迹象。随后对2、4号隔离器中对照组鸡进行细菌的分离培养及PCR检测鉴定,证明所分离到的菌株为副鸡禽杆菌。
2.6  血清型鉴定结果  将所分离到平谷株、延庆株Apg经匈牙利诗华研发中心代为鉴定,其结果为B型副鸡禽杆菌。
2.7  序列测定与分析结果  经序列测定,克隆的PCR产物长度为500bp,与预期的扩增片段长度相符。应用DNASTAR软件进行基因核苷酸序列遗传距离分析,结果显示平谷株、延庆株基因序列同源性达到99.6%,而与NCBI基因库中参考株(GenBank登录号:DQ132874.1)Modesto的基因序列同源性达到98.3%、98.8%,结果见图2
(略)。
3、讨论:
3.1
本试验中,分离菌在含NAD的鸡血清琼脂平皿上呈露滴状生长,在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长;革兰氏染色为阴性短杆菌,两极浓染;过氧化氢酶试验结果为阴性;无菌检验显示在GA、GP上均无菌生长,但在TG小管中有轻微细菌生长;将分离菌人工感染SPF鸡24h后均出现眶下窦及脸部严重肿胀、食欲减退、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC临床发病症状,同时在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡禽杆菌;在PCR结果阳性的基础上,用已知Apg A型鼻炎灭活疫苗免疫SPF鸡后接种平谷、延庆分离菌株均不能保护,而接种A型菌株的对照组100%保护(4/4)证明所分离到的Apg肯定不是A型。为了进一步验证分离物,将分离到的Apg送匈牙利诗华研发中心代为鉴定。鉴定结果与攻毒保护试验结果一致,可以判定该分离物为B型副鸡禽杆菌,暂命名为副鸡禽杆菌平谷株和延庆株。
3.2 鸡传染性鼻炎传播途径主要以飞沫及尘埃经呼吸传播,本次传播试验中,使用相同面积饲养的1、3号隔离器内的6只鸡没有发生水平传播现象,而2、4号隔离器内的14只鸡在攻毒后第5天相继出现了精神沉郁、食欲减退、鼻孔有粘性分泌物流出、脸部肿胀、打喷嚏、缩头、呆立等IC发病迹象。由此可见,本病的发生和反复发作与饲养密度有很大的关系。
3.3 由免疫攻毒试验得知,传染性鼻炎A型灭活疫苗免疫过的SPF鸡对平谷、延庆分离菌株的攻击没有起到保护作用,此结果与该菌株的血清型的鉴定结论相一致。由于灭活的鸡传染性鼻炎疫苗只提供针对疫苗中含有的Page血清型的保护,因此菌苗中关键要含有目标鸡群中存在的血清型。Page B型已经证实是一种真正存在的具有完全致病性的血清型,并且发生很广,这就是说,在存在血清型B的地区使用的灭活菌苗中必须含有这一血清型。然而,由于血清型B的不同菌株间只能提供部分交叉保护[10],
因此在血清型B流行的地区可能有必要加快鸡传染性鼻炎多价疫苗的研究。
参考文献(略)