研发成果 > 几株鸡新城疫病毒的分离鉴定及基因型分析
您现在的位置:首页 > 技术讲座
几株鸡新城疫病毒的分离鉴定及基因型分析

孙丰廷,郑杰,张发明,崔惠娟,杨国良,张红,张坦,张亮,陈玲,李静,王文泉

摘要:从几个发生禽病的地区分离到6株病毒,经过HA、HI、中和试验、分子生物学试验等确定为鸡新城疫病毒;根据GeneBank公布的新城疫F基因强弱毒株相关基因序列设计合成一对特异性引物,扩增出的F基因片段长度大约为610 bp,测序后进行序列比对,并分析其核苷酸序列和氨基酸序列,结果显示,有3株具有新城疫强毒株特性,同时还具备新城疫Ⅶ基因型特征,另外根据MDT、ICPI和IVPI指标测定结果,最终判定此3株是新城疫强毒株且属于基因Ⅶ型,其余3株病毒分离株与Lasota的核酸序列同源性与氨基酸序列同源性均为99%。
关键词:新城疫;F基因;强毒株;基因Ⅶ型;
  新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽类的一种以呼吸道、消化道、胃肠道和中枢神经系统损伤为主要特征的急性、高度接触性传染病,是危害养禽业生产的最严重疾病之一(崔治中,2002)。
  新城疫病毒(NDV)属禽副黏病毒1型(AMPV21),为有囊膜的单股、负链RNA病毒,大小约15 kb,其基因组编码6种病毒结构蛋白,即NP蛋白、P磷蛋白、M基质蛋白、F融合蛋白、HN血凝素—神经氨酸酶和L聚合酶,其中,融合蛋白F是NDV的功能性糖蛋白之一,在致病和免疫应答过程中起着重要作用(Murphy,1995)。NDV根据其致病性分为速发型(Velogenic,又称强毒型)、中发型(Mesogenic,)和缓发型(Lesogenic)(殷震,1997)。强毒株具有高度的致病性,在感染后2~3 d内几乎可使所有禽类死亡;弱毒株表现为非致病性,常用作疫苗株。2011年本试验从华东地区、东北地区和华北地区的发病鸡场分离到6株病毒,经过HA、HI、中和试验、分子生物学试验等确定为鸡新城疫病毒,并进一步对F基因裂解位点进行扩增、测序和比对,发现有3株病毒分离株为基因型Ⅶ强毒株。 
1 材料与方法
1.1材料

1.1.1病料、血清及主要试剂  NDV病料的分离由华都诗华生物制品有限公司分子生物学实验室完成;10日龄SPF鸡胚,由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供;NDV标准阳性血清、NDV标准阴性血清、AIV H9和H5标准阳性血清、减蛋综合征阳性血清,均购自中国兽医药品监察所;反转录试剂盒、DEPC、dNTPs、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,均为大连宝生物公司产品。
引物合成:根据发表的NDV F基因核苷酸序列,设计了一对简并引物,由Invitrogen北京分公司合成。引物序列为:上游引物P1:5ˊ- TTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA -3ˊ;下游引物P2:5ˊ- ACAAARTGRTGCATCTTCCC -3ˊ。
1.2 方法
1.2.1病毒的分离  无菌取病死鸡的脑组织,按照1:3比例加入灭菌生理盐水研磨成乳悬液,冻融3次后用0.2 µm滤膜过滤除菌,2000 r/min离心10 min,取上清液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,每枚接种0.2 mL,无菌收取接种24 h后死亡鸡胚的尿囊液,分别命名为大连(DL)株、滦平(LP)株、周口店(ZKD)株、瓦房店(WFD)株、潍坊(WF)株、烟台(YT)株,置-20 ℃保存备用。
1.2.2血凝试验和血凝抑制试验  分别取NDV标准阳性血清、NDV标准阴性血清、AIV H9和H5标准阳性血清、减蛋综合征阳性血清,按常规方法进行。
1.2.3动物回归试验  将分离得到的病毒液经滴鼻、点眼途径人工感染10只30日龄的SPF鸡,每只0.5 mL(含105个EID50)。观察记录鸡群变化,对死亡鸡只进行解剖观察。
1.2.4最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间测定  用无菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液作10倍系列梯度稀释,取10-7~10-9 ,连续3个稀释度,分别接种10日龄SPF鸡胚。每个稀释度接种5个鸡胚,每胚尿囊内注射0.1 mL,作记号“A”。接种后剩余的病毒稀释液放4℃保存,A接种9h后每个稀释度分别再接种剩余的5个鸡胚,作记号“B”。接种后,每天在A、B两个接种时间点A、B组各照蛋一次,记录每一鸡胚的死亡时间,并测定每胚血凝(HA)活性。观察7日后,将所有活胚冷却,测定每胚HA活性。
上午和下午接种的鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量,然后计算最小致死量的平均死亡时间。
1.2.5脑内致病指数(ICPI)的测定  取1日龄SPF雏鸡10只,分别于脑内内注射10-1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05 mL,接种针头直径0.45 mm,长5 mm。另外两只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05 mL。接种后,每日在相应接种时间内观察,记录雏鸡的情况,分正常(活动灵活,行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起,但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。
观察8日,计算正常、发病、死亡鸡的总数,根据不同的权值(正常为0,发病为1,死亡为2)累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。
1.2.6静脉致病指数(IVPI)的测定  取6周龄SPF鸡10只,静脉接种10-1稀释的含毒尿囊液0.1 mL,另取2只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察,记录接种鸡的情况,分正常、发病(鸡只蜷缩在一起不愿运动,不愿采食或饮水,但无明显的翅、腿麻痹表现)、麻痹(翅、腿明显不协调,翅膀下垂和死亡)。
观察10日后,累计正常、发病、麻痹和死亡动物数,根据不同权值(正常为0,发病为1,麻痹为2,死亡为3)累计总分数。IVPI为累计总分数除以正常、发病、麻痹和死亡动物的累计总数。
1.2.7病毒RNA的提取  将分离到的6株毒株分别接种于10日龄SPF鸡胚,收集在24 h内死亡的尿囊液,参照说明书提取病毒RNA。
1.2.8 RT反应与PCR反应按照常规方法进行  取PCR产物5 µL,用1%琼脂糖凝胶电泳分析所扩增片段的大小。
1.2.9序列测定与分析  从琼脂糖中回收PCR产物目的片段,用双脱氧法直接对PCR产物进行测序,为了保证序列准确性,同时反向测定序列加以验证。通过GenBank与已发表的NDV F基因序列进行比较,并对由核苷酸序列推导出来的氨基酸序列进行比较。
将所测定的6株NDV分离株的F基因序列与NCBI基因库中的10株NDV参考株相应序列分别进行比较,并进行系统进化树分析。2.1病毒分离  分别接种6株毒株的鸡胚,其中有3株鸡胚在接种后35~45 h死亡,且鸡胚呈现以下病变:整个胚体充血,在头、腹、背、翅和趾部有出血点,尤其是脚趾部位较明显。剩余3株死亡时间均大于90 h或未死亡,鸡胚症状不明显,个别可见脚趾部位有出血现象。
2.2血凝与血凝抑制试验  6株毒株均具有血凝性,且血凝效价平均在6左右。病毒株的血凝性可以被NDV阳性血清所抑制,但不能被禽流感病毒H9和H5阳性血清、减蛋综合征阳性血清所抑制,从而可以判定所分离到的6株毒株均为NDV毒株。
2.3动物回归试验结果
  6个分离株中WFD株、WF株、YT株分别感染10只SPF鸡后在3~5 d内陆续死亡,剖解可见肠道有典型的枣核状出血,有神经症状。DL株、LP株、ZKD株均未出现死亡,剖解未见病变出现。
2.4最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)、静脉致病指数(IVPI)结果  具体结果见表2(略)。从表中数据可以看出,6个分离株中WFD株、WF株、YT株平均死亡时间均在50 h之前,脑内致病指数和静脉致病指数均较高;其余三株均在70 h之后,脑内致病指数和静脉致病指数相对均较低。
2.5序列测定与分析
2.5.1 RT-PCR  用TRIZOL法提取病毒中的RNA,经RT-PCR扩增后,用1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示6株毒株均在610 bp左右出现特异性扩增条带,与预期的扩增片段大小一致,其中3株的电泳图见图3(略)。
 2.5.2分离株F基因的核苷酸和氨基酸序列分析  6株病毒分离株F基因的扩增长度均为610 bp与预期扩增片段长度相符。应用BioEdit软件推导出分离株的氨基酸序列,发现其中3株分离株,WFD株、WF株、YT株在112-117裂解位点处的氨基酸顺序为“112-R-R-Q-K-R-F-117”,表明这3株分离株是NDV强毒株,同时,还具备NDV Ⅶ基因型的典型特征,即在101、121位置处分别有K、V两个特征性氨基酸;而DL株、LP株、ZKD株在112-117裂解位点处的氨基酸顺序为“112-G-R-Q-G-R-L-117”,即在101、121两个位置处分别为R和I,表明这3株分离株是NDV弱毒株,
2.5.3进化树的构建  将分离到的6株NDV分离株的F基因序列与10株国内外NDV参考株相应序列进行分析,应用MEGA 4软件进行系统进化树分析,结果见图2。由图2(略)可知,分离到的WFD、WF、YT3株NDV分离株与参考株CH2000形成一个分支,为NDV基因Ⅶ型。DL、LP、ZKD3株与Lasota属同一个分支,为NDV基因Ⅱ型。
3.讨论
  近年来,国内普遍采用Lasota等毒株制备的弱毒苗或灭活苗进行新城疫的免疫,而随着基因Ⅶ型NDV所引起的ND在国内呈流行趋势(刘华雷,2002),加重了防控的难度,甚至是在高抗体水平的鸡群如肉种鸡和蛋鸡,仍然发病报道(张玉霞,2010),这可能预示传统疫苗的保护效果下降,因此只进行传统疫苗Lasota毒株免疫并不能达到理想的保护效果,强毒株的致病特点是,发病迅速,周期短,死亡率高。这对免疫提出了更高的要求。
  本研究从发病鸡群中分离到6株NDV毒株,均具有HA活性,且可被NDV标准阳性血清所抑制,而不能被AIV和EDSV标准阳性血清抑制。进一步应用RT-PCR技术对F基因部分片段进行扩增和序列测定,与国内外参考毒株比较发现,其中3株NDV分离株与参考强毒株CH2000、TW2000的同源性较高,其核酸序列同源性在93%-96%之间,氨基酸序列同源性在94%~95%之间,而与传统疫苗株B1、Lasota的同源性偏低,其核酸序列同源性在82%-83%之间,氨基酸序列同源性在82%~84%之间。这些结果表明,这3株NDV分离株与目前使用的疫苗株在基因水平上存在一定的差异,这可能会为免疫鸡群中高致病力NDV毒株的感染和流行创造条件。另外三株与Lasota在基因进化树上属于同一个分支,核酸序列同源性与氨基酸序列同源性均为99%。
NDV毒力强弱与F蛋白的F1/F2多肽裂解位点(112-117氨基酸残基)的序列差异有关,NDV强毒株在该区域的氨基酸残基为112-R-R-Q-R/K-R-F-117,NDV弱毒株在该区域的氨基酸残基为112-G/E-K/R-Q-G/E-R-L-117(Paterson,1989)。通过对分离到的3株NDV分离株的F基因氨基酸序列进行分析,发现其在F1/F2多肽裂解位点的序列均为112-R-R-Q-K-R-F-117,这与NDV强毒株的特征相符,从而更进一步在分子水平上证明了分离到的3株NDV分离株为强毒株,这也与测定的静脉接种指数等结果相符。
  F基因是决定NDV毒力强弱的重要区域,因此可以对F基因片段进行分析,把它作为NDV毒株遗传学分群的重要指标(梁华,2005)。基因遗传进化树分析的方法不仅可以显示出病毒间的遗传关系,还能较清楚地反映其动态传播过程及流行病学特点,不失为一种快速、简便的NDV分类方法。刘华雷等(2002)、李春华等(2008)就是通过构建NDV的F基因遗传进化树,从而判定分离到的是NDV基因Ⅶ型。我们通过对NDV分离株的F基因片段进行RT-PCR扩增、序列测定,同时与10株NDV参考株的相应F基因序列进行比较,构建NDV的F基因遗传进化树,发现其中3株NDV分离株在分类地位上与CH2000、TW2000等较为相似,在分类地位上均属于基因Ⅶ型,另外3株属于弱毒株,与Lasota亲缘关系较近。