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马立克“814”液氮疫苗以及毒株的研究进展
郑杰 张洪 王文泉 张发明 张红 马力 李伟

摘要:为了让马立克“814”液氮疫苗的使用者更好的了解该疫苗的历史渊源和目前的进展,本文从“814”毒株的分离鉴定、纯化、疫苗的工艺改进、毒株的分子生物学特性、与同类产品使用效果比较,以及多价疫苗的研究进展做了一个综述。
马立克“814”毒株是中国自主分离的一株较低毒力的毒株,由该毒株制成的马立克“814”液氮疫苗是我国具有自主知识产权的疫苗产品之一, 是目前我国唯一的血清I型疫苗毒株,具有安全稳定、良好的免疫原性、受母源抗体干扰小的特点;该疫苗的规模化生产和使用,已经逐步改变了马立克疫苗用户对进口疫苗的依赖;随着马立克“814”液氮疫苗的大规模化推广和使用,该疫苗在中国的市场占有率逐年提高,据不完全统计目前已经占到全国市场的10%左右,为了使更多的使用者了解马立克“814”液氮疫苗的前世今生,本文对马立克“814”毒株和疫苗的演变历史、毒株纯化、生产工艺改进、免疫效力、疫苗免疫对其他重要疫病抗体的影响,以及“814毒株”的分子生物学研究进展做了综述。
一、历史
马立克“814”株是我国哈尔滨兽医研究所童昆周先生在1980年从多年来没有发生马立克、健康的黑龙江某白洛克鸡群中分离获得,并通过用鸡胚皮肤细胞成功培育出的我国惟一的可用于疫苗生产的血清I型毒株,该毒株安全稳定,受母源抗体影响小,具有良好的免疫原性 [1,2,3] 。1981年4月通过系统鉴定的毒株被命名为“814”K株。
童昆周先生[1]对经过培育的“814”K株进行了安全试验、稳定性试验和效力试验,证明“814”K株对鸡是安全的,毒株是稳定的,效力是可靠的,同火鸡疱疹病毒(HVT)进行对比,结果证明K株对鸡的免疫效力(81.25-93.75%)明显高于HVT的效力(60.5%)。
童先生等用K株制造的疫苗做了大面积的区域试验,证明安全有效,免疫效力比HVT好[1],由于“814”液氮疫苗的在安全和效力等各个方面的卓越表现,1984年被中华人民共和国农业部批准为生物制品规程产品[2]。
二、病毒纯化和工艺改进
马立克“814”液氮疫苗在1984年被我国正式批准进入兽医生物制品规程,但由于当时受条件制约,毒株未做纯化不能投入规模化生产。从2000年开始,北京市兽医生物药品厂组织技术人员[4]对“814”疫苗毒株进行了多代次的净化和纯化,排除了被家禽各种病源污染的可能,保证了疫苗没有外源病原污染,尤其是禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生病毒等免疫抑制性病原微生物,净化了“814”弱毒株,在通过严格的质量鉴定后,建立了用于传代的基础毒株和用于生产的种毒株,在形成了成熟的生产工艺后,经中监所批准正式投入生产。实践证明,使用“814”液氮疫苗免疫后马立克减少率高于国外同类产品;由于该疫苗安全性好,效力高,PFU的含量高出规程的一倍以上,被我国兽医专家[5]推荐用于MD病的高发区和超强毒区,被称为免疫效力更强的疫苗。
转瓶培养是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式,但转瓶培养存在着细胞生长密度低、转瓶间细胞生长差异大、劳动强度大、占用空间大、能耗高、水耗量大等缺点。2004年,北京市兽医生物药品厂采用细胞工厂代替传统的转瓶培养细胞来生产疫苗,在细胞工厂中,细胞生长更接近自然状态,可形成均一的细胞单层;由于材料对细胞的影响非常小,细胞的活力更强,病毒在细胞内生长更快,感染细胞率明显提高;经过工艺优化后,用细胞工厂生产的鸡马立克氏病液氮疫苗“814株”的质量优良,免疫效力高,免疫效果稳定,与国外进口同类疫苗相比预防效果差异不显著,除此之外,其还有代次低、蚀斑小、PFU含量高,免疫原性好、成本低等优点。
在进行工艺优化的同时,还特别研制出华都“814”专用稀释液,添加进口新生牛血清、免疫增强因子等,使用时有助于细胞活力迅速恢复,从而保证了疫苗毒的活性,最大限度的保证了病毒的蚀斑数
三、分子生物学研究进展
马立克“814”株是我国科研人员从现地分离的自然弱毒株,并未经过细胞传代的致弱。作为我国特有的疫苗株,对其全基因组背景的了解并不清楚,因此,刘长军等[3]对“814”株的全基因组序列进行了测定和分析。经PCR扩增,目的片段的克隆,序列拼接以及分析,首次获得了马立克氏病病毒I型中国疫苗株“814”的全基因组序列。马立克“814株”全长为172,541bp,其基因组中基因结构组成与其他的MDVI型毒株相同。遗传进化树分析表明,“814”与疫苗株CVI988的亲缘关系最近。与GenBank登录的强、弱毒株进行比较分析表明:814株基因组长重复区在编码Meq、RLORF6和23KDa的重叠基因内具有177bp的插入。814株在RLORF12基因编码区内存在69bp的缺失,此缺失位于复制起始位点内。在编码大的间质蛋白的UL36基因中,与疫苗株CVI988相比,MDV 814株缺失510bp。SNP的鉴定发现,总计24个SNP是疫苗株814、CVI988共有的,不出现在强毒株中,被鉴定SNP发生在基因UL12、UL38、UL39、等18个编码的蛋白质中。同时,发现43个814疫苗株特有的氨基酸突变,分布在23个开放阅读框内。
CVI988和814同属于疫苗株,SNP分析表明814株的基因组和致弱疫苗株CVI988的基因组非常相似。但是814株分离的年代,中国还未曾引入CVI988疫苗。说明这些变化是疫苗株所特有的[3] 。
韦平等[6]通过研究发现,在系统进化树和SNP上,与马立克广西分离株在gE、gI和MEQ基因水平上相比,马立克“814”与广西马立克分离株的亲缘关系比CVI988近,并进一步分析指出,对于广西马立克的预防,使用马立克“814”疫苗要优于CVI988疫苗。
四、与CVI988疫苗的比较试验
马力等[7]利用国内经纯化、生产的低代次“814”疫苗与国外2个厂家生产的CVI988疫苗同时免疫1日龄SPF雏鸡 ,再用国内马立克氏病标准强毒株京-1 株攻击 ,分别隔离饲养62d后,剖检观察病变。试验结果表明,国产的“814”疫苗与进口疫苗的保护率差异不显著。
五、对新城疫等鸡的重要传染病抗体产生的影响
马立克疫苗一般在1日龄免疫,马立克疫苗免疫后马立克氏病病毒是否会损害鸡的免疫器官,免疫后是否会新城疫、禽流感,传染性法氏囊,鸡传染性支气管炎等是鸡的最主要的几个传染病抗体的产生,一直存在争议。
张崎蜀等[8]先用马立克“814”疫苗进行胚胎免疫或一日龄雏鸡免疫,然后进行新城疫IV系弱毒疫苗免疫。试验结果表明,“814”疫苗对雏鸡免疫系统从机能方面讲是安全的,胚胎免疫组和一日龄雏鸡免疫组与对照组对新城疫疫苗免疫的反应性无显著性差异。
通过本实验可以说明马立克疫苗免疫后,不会对新城疫等抗体产生影响,说明马立克“814”液氮疫苗是安全、可靠的。
六、研究者对北京市兽医生物药品厂生产的“814”疫苗的评价
2003年童昆周先生[2]发表文章总结的该疫苗的优点,在特定的条件下筛选出来的“814” 弱毒株,已被证实是一株符合制造优质弱毒疫苗的自然弱毒株。“814”弱毒疫苗和同类疫苗相比毫不逊色,其高度的安全性、稳定性、免疫效力和有效代次长的细胞传代等是它的显著优质特性,物美价廉则是它独有的特色。北京市兽医生物药品厂生产的“814”弱毒疫苗质量有保证,已成为鸡马立克氏病防控的优质品牌产品。
七、多价疫苗的研究进展
徐宜为等[9]用“814”和HVT疫苗匹配组成双价疫苗,进行实验室和田间免疫效力试验,实验室实验和田间效力试验表明有“814”和HVT匹配构成的双价疫苗,免疫效果好,优于单价疫苗,尤其明显优于HVT单价疫苗。
刘长军等[10]研制的三价活疫苗是基于Ⅰ型,Ⅱ型,Ⅲ型不同血清型毒株间的免疫协同作用理论研制的三价疫苗,由血清I型“814”株、血清II型SB1株和HVT FC-126株三种毒株组成,实验室攻击,马立克保护指数90%以上,达到了国际同类疫苗的先进水平,该疫苗免疫后8天可以生坚强的免疫保护力,免疫期1年以上。
以上疫苗由于这样或那样的原因,没有进入农业部的规程,为了更好的进行马立克氏病的预防,北京市兽医生物药品厂和中国兽医药品监察所合作,进行了马立克氏病二价活疫苗的研制,马立克二价活疫苗是基于马立克不同血清型毒株间的免疫协同作用理论研制的马立克疫苗,由马立克血清I型“814”株和血清Ⅲ型HVT株二种毒株组成。目前已经获得临床批件,预计在不久的将来,养禽业者在预防马立克氏病方面将会多一种选择。
参考文献